Análise computacional da regulação da expressão gênica em Trypanosoma cruzi

Orientador : Prof. Dr. Christian Macagnan ProbstCoorientador : Prof. Dr. Marco Aurélio KriegerTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/08/2012Inclui referênciasÀrea de concentração: Biologia celular e molecularResumo: Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da Doença de Chagas, um sério problema de saúde pública na América Latina. Além disso, divergiu muito cedo da linhagem principal dos eucariotos e possui características moleculares muito peculiares, como transcrição policistrônica, processamento dos transcritos por trans-splicing e a regulação da expressão gênica pós-transcricional. O estudo sistemático e amplo das questões relacionadas à expressão gênica em T. cruzi, principalmente sobre uma perspectiva ômica, é essencial para que possamos entender esses aspectos, identificando novos mecanismos, e proporcionando alvos para a definição de melhores terapias. O presente trabalho visa estabelecer uma plataforma computacional para o projeto "Reguloma de T. cruzi", utilizando técnicas bioinformáticas para aprofundar o entendimento sobre a regulação da expressão gênica desse parasita. Para isso, foi implementado um banco computacional para armazenamento de dados ômicos de tripanossomatídeos, que comporte a quantidade e a complexidade dos dados que estão sendo gerados pelo Projeto Reguloma do Instituto Carlos Chagas. A esse banco foram incorporadas informações relativas a genoma, transcriptoma, ribonoma, proteoma, fosfoproteoma, interatoma, primariamente de resultados que estão sendo produzidos pelo nosso grupo. Associado a isso, as informações relativas a metabolismo (KEGG), domínios protéicos (PFAM) e anotação gênica funcional (Gene Ontology) foram também incorporados. Um aspecto central é a natureza redundante dos dados existentes sobre as regiões codificadoras de T. cruzi, as quais foram organizadas. Para exemplificar a utilização dessa plataforma, mostramos a sua aplicação em dados transcriptômicos obtidos pela técnica de RNA-Seq do ciclo de vida de T. cruzi, abrangendo as quatro formas principais do parasita, e a sua integração com dados metabólicos, de domínios proteicos e identificação de motivos presentes na região 3'UTR que influenciam os padrões de expressão analisados. Para esse último tópico, é essencial a correta definição dos limites dos mRNAs de T. cruzi, e para isso utilizamos todos os dados existentes atualmente em nosso grupo (2,6 bilhões de leituras) para predizer bioinformaticamente as regiões de adição do mini-éxon e da cauda poli-A nos mRNAs de T. cruzi. Os dados resultantes dessa análise possibilitam uma avaliação mais correta e poderosa sobre os determinantes dos padrões de expressão existentes no projeto Reguloma. Para a caracterização de motivos regulatórios candidatos, fizemos a definição de amostras controles, sendo que a definição de condições opostas como um possível controle é uma abordagem inédita na análise de elementos reguladores. Finalmente, também demonstramos a aplicação dessa plataforma na integração dinâmica de dados de RNA-Seq com o metabolismo do organismo, o que cria um nível adicional de complexidade nas análises passíveis de serem realizadas. Portanto, o presente trabalho representa a construção de um arcabouço sobre o qual as futuras análises do projeto Reguloma poderão ser feitas, visando obter os elementos e as relações entre os mesmos, construindo uma rede biológica regulatória. Com a incorporação de um grande número de dados referentes às mais diversas caracterizações ômicas, que estão sendo geradas primariamente por nosso grupo, vislumbra-se que a infraestrutura bioinformática apresentada nesse trabalho viabilizará a realização de análises sistêmicas, promovendo o avanço do conhecimento científico sobre a regulação da expressão gênica de T. cruzi

Proteomics uncovers novel components of an interactive protein network supporting RNA export in trypanosomes

In trypanosomatids, transcription is polycistronic and all mRNAs are processed by trans-splicing, with export mediated by noncanonical mechanisms. Although mRNA export is central to gene regulation and expression, few orthologs of proteins involved in mRNA export in higher eukaryotes are detectable in trypanosome genomes, necessitating direct identification of protein components. We previously described conserved mRNA export pathway components in Trypanosoma cruzi, including orthologs of Sub2, a component of the TREX complex, and eIF4AIII (previously Hel45), a core component of the exon junction complex (EJC). Here, we searched for protein interactors of both proteins using cryomilling and mass spectrometry. Significant overlap between TcSub2 and TceIF4AIII-interacting protein cohorts suggests that both proteins associate with similar machinery. We identified several interactions with conserved core components of the EJC and multiple additional complexes, together with proteins specific to trypanosomatids. Additional immunoisolations of kinetoplastid-specific proteins both validated and extended the superinteractome, which is capable of supporting RNA processing from splicing through to nuclear export and cytoplasmic events. We also suggest that only proteomics is powerful enough to uncover the high connectivity between multiple aspects of mRNA metabolism and to uncover kinetoplastid-specific components that create a unique amalgam to support trypanosome mRNA maturation

Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition)1.

In 2008, we published the first set of guidelines for standardizing research in autophagy. Since then, this topic has received increasing attention, and many scientists have entered the field. Our knowledge base and relevant new technologies have also been expanding. Thus, it is important to formulate on a regular basis updated guidelines for monitoring autophagy in different organisms. Despite numerous reviews, there continues to be confusion regarding acceptable methods to evaluate autophagy, especially in multicellular eukaryotes. Here, we present a set of guidelines for investigators to select and interpret methods to examine autophagy and related processes, and for reviewers to provide realistic and reasonable critiques of reports that are focused on these processes. These guidelines are not meant to be a dogmatic set of rules, because the appropriateness of any assay largely depends on the question being asked and the system being used. Moreover, no individual assay is perfect for every situation, calling for the use of multiple techniques to properly monitor autophagy in each experimental setting. Finally, several core components of the autophagy machinery have been implicated in distinct autophagic processes (canonical and noncanonical autophagy), implying that genetic approaches to block autophagy should rely on targeting two or more autophagy-related genes that ideally participate in distinct steps of the pathway. Along similar lines, because multiple proteins involved in autophagy also regulate other cellular pathways including apoptosis, not all of them can be used as a specific marker for bona fide autophagic responses. Here, we critically discuss current methods of assessing autophagy and the information they can, or cannot, provide. Our ultimate goal is to encourage intellectual and technical innovation in the field

História evolutiva dos LTR-retrotransposons Tom, 297, 17.6 e rover em Drosophilidae

Os elementos de transposição 297, 17.6 e rover de Drosophila melanogaster e Tom de D. anannassae são retrovírus endógenos de insetos filogeneticamente relacionados. Uma análise inicial da distribuição de seqüências homólogas aos retroelementos 297, 17.6 e Tom em 33 espécies Neotropicais de Drosophila, Zaprionus indianus e Scaptodrosophila latifasciaeformis, utilizando Dot Blot e PCR, indicou a distribuição restrita desses elementos ao grupo melanogaster e em Z. indianus. Essa análise inicial motivou-nos a fazer este trabalho, com o objetivo de entender a história evolutiva destes três retroelementos. Para isso, clonamos e seqüenciamos uma região da transcriptase reversa nessas espécies e buscamos nos doze genomas de Drosophila atualmente disponíveis seqüências homólogas a estes elementos. Os dados das seqüências de alguns clones indicaram a amplificação de outro elemento, o retroelemento rover, que também foi analisado neste estudo. A dinâmica evolutiva dos retroelementos Tom, 297, 17.6 e rover nos genomas de Drosophilidae são coincidentes em muitos aspectos: (1) Em uma visão geral, as filogenias de cada família são discordantes da filogenia das espécies hospedeiras; (2) Os quatro retroelementos estão envolvidos em eventos de transmissão horizontal; (3) As relações entre as seqüências dos elementos das diferentes espécies são complexas, dificultando a compreensão do cenário evolutivo dos elementos; (4) Os quatro retroelementos apresentam um menor viés na utilização de códons se comparados aos genes nucleares; (5) Pelo menos os elementos 297, 17.6 e rover apresentam valores médios de dN/dS equivalentes ao apresentado pelos genes nucleares, o que indica que essas famílias estão evoluindo sob restrição seletiva. Análises filogenéticas e de divergência nos sítios sinônimos das seqüências da transcriptase reversa dos quatro retroelementos indicam que diferentes eventos podem explicar a história evolutiva desses elementos, incluindo polimorfismo ancestral, transmissão vertical, perda estocástica e transmissão horizontal. Os dados apresentados sugerem que no mínimo 16 casos de transmissão horizontal são necessários para explicar o cenário evolutivo apresentado por esses retroelementos.The transposable elements 297, 17.6 and rover from D. melanogaster and Tom from D. ananassae are closelly related insect endogenous retroviruses. An initial Dot Blot and PCR analysis of the distribution of sequences homologues to retroelements 297, 17.6 and Tom in 33 Drosophila Neotropical species, plus Zaprionus indianus and Scaptodrosophila latifasciaeformis, indicates that the distribution of these elements is restricted to the Drosophila melanogaster subgroup and Z. indianus. In order to understand the evolutionary history of these three elements, we have cloned and sequenced a transcriptase reverse region in these species and searched through sequences homologues to these elements in the twelve available Drosophila genomes. Some cloned sequences denote another element being amplified, the rover retrotransposon, which was included in this work. The evolutionary patterns of the retrotransposons Tom, 297, 17.6 and rover in Drosophilidae genomes agree in several aspects: (1) The retrotransposons phylogenies disagree with the host species phylogeny; (2) The four elements are involved in horizontal transfer events; (3) The relationships among sequences of different species are complex; (4) The four retroelements display a lower codon usage bias than nuclear genes; (5) 297, 17.6 and rover showed dN/dS ratio similar to nuclear genes dN/dS ratio, indicating selective constraints. Phylogenetic analysis and divergence in synounymous sites of reverse transcriptase sequences from these four retroelements indicate different events explaining their evolutionary history, including ancestral polymorphism, vertical transmission, stocastic loss and horizontal transfer. Our data suggest sixteen events of horizontal transfer to explain the evolutionary scenario of 297, 17.6, rover and Tom

História evolutiva dos LTR-retrotransposons Tom, 297, 17.6 e rover em Drosophilidae

Os elementos de transposição 297, 17.6 e rover de Drosophila melanogaster e Tom de D. anannassae são retrovírus endógenos de insetos filogeneticamente relacionados. Uma análise inicial da distribuição de seqüências homólogas aos retroelementos 297, 17.6 e Tom em 33 espécies Neotropicais de Drosophila, Zaprionus indianus e Scaptodrosophila latifasciaeformis, utilizando Dot Blot e PCR, indicou a distribuição restrita desses elementos ao grupo melanogaster e em Z. indianus. Essa análise inicial motivou-nos a fazer este trabalho, com o objetivo de entender a história evolutiva destes três retroelementos. Para isso, clonamos e seqüenciamos uma região da transcriptase reversa nessas espécies e buscamos nos doze genomas de Drosophila atualmente disponíveis seqüências homólogas a estes elementos. Os dados das seqüências de alguns clones indicaram a amplificação de outro elemento, o retroelemento rover, que também foi analisado neste estudo. A dinâmica evolutiva dos retroelementos Tom, 297, 17.6 e rover nos genomas de Drosophilidae são coincidentes em muitos aspectos: (1) Em uma visão geral, as filogenias de cada família são discordantes da filogenia das espécies hospedeiras; (2) Os quatro retroelementos estão envolvidos em eventos de transmissão horizontal; (3) As relações entre as seqüências dos elementos das diferentes espécies são complexas, dificultando a compreensão do cenário evolutivo dos elementos; (4) Os quatro retroelementos apresentam um menor viés na utilização de códons se comparados aos genes nucleares; (5) Pelo menos os elementos 297, 17.6 e rover apresentam valores médios de dN/dS equivalentes ao apresentado pelos genes nucleares, o que indica que essas famílias estão evoluindo sob restrição seletiva. Análises filogenéticas e de divergência nos sítios sinônimos das seqüências da transcriptase reversa dos quatro retroelementos indicam que diferentes eventos podem explicar a história evolutiva desses elementos, incluindo polimorfismo ancestral, transmissão vertical, perda estocástica e transmissão horizontal. Os dados apresentados sugerem que no mínimo 16 casos de transmissão horizontal são necessários para explicar o cenário evolutivo apresentado por esses retroelementos.The transposable elements 297, 17.6 and rover from D. melanogaster and Tom from D. ananassae are closelly related insect endogenous retroviruses. An initial Dot Blot and PCR analysis of the distribution of sequences homologues to retroelements 297, 17.6 and Tom in 33 Drosophila Neotropical species, plus Zaprionus indianus and Scaptodrosophila latifasciaeformis, indicates that the distribution of these elements is restricted to the Drosophila melanogaster subgroup and Z. indianus. In order to understand the evolutionary history of these three elements, we have cloned and sequenced a transcriptase reverse region in these species and searched through sequences homologues to these elements in the twelve available Drosophila genomes. Some cloned sequences denote another element being amplified, the rover retrotransposon, which was included in this work. The evolutionary patterns of the retrotransposons Tom, 297, 17.6 and rover in Drosophilidae genomes agree in several aspects: (1) The retrotransposons phylogenies disagree with the host species phylogeny; (2) The four elements are involved in horizontal transfer events; (3) The relationships among sequences of different species are complex; (4) The four retroelements display a lower codon usage bias than nuclear genes; (5) 297, 17.6 and rover showed dN/dS ratio similar to nuclear genes dN/dS ratio, indicating selective constraints. Phylogenetic analysis and divergence in synounymous sites of reverse transcriptase sequences from these four retroelements indicate different events explaining their evolutionary history, including ancestral polymorphism, vertical transmission, stocastic loss and horizontal transfer. Our data suggest sixteen events of horizontal transfer to explain the evolutionary scenario of 297, 17.6, rover and Tom

Development of a gene-centered ssr atlas as a resource for papaya (Carica papaya) marker-assisted selection and population genetic studies.

Carica papaya (papaya) is an economically important tropical fruit. Molecular marker-assisted selection is an inexpensive and reliable tool that has been widely used to improve fruit quality traits and resistance against diseases. In the present study we report the development and validation of an atlas of papaya simple sequence repeat (SSR) markers. We integrated gene predictions and functional annotations to provide a gene-centered perspective for marker-assisted selection studies. Our atlas comprises 160,318 SSRs, from which 21,231 were located in genic regions (i.e. inside exons, exon-intron junctions or introns). A total of 116,453 (72.6%) of all identified repeats were successfully mapped to one of the nine papaya linkage groups. Primer pairs were designed for markers from 9,594 genes (34.5% of the papaya gene complement). Using papaya-tomato orthology assessments, we assembled a list of 300 genes (comprising 785 SSRs) potentially involved in fruit ripening. We validated our atlas by screening 73 SSR markers (including 25 fruit ripening genes), achieving 100% amplification rate and uncovering 26% polymorphism rate between the parental genotypes (Sekati and JS12). The SSR atlas presented here is the first comprehensive gene-centered collection of annotated and genome positioned papaya SSRs. These features combined with thousands of high-quality primer pairs make the atlas an important resource for the papaya research community

Distribution of SSR type according to genomic location.

<p>Distribution of SSR type according to genomic location.</p

Distribution of SSRs by genomic location.

<p>Distribution of SSRs by genomic location.</p